Biologija 4 > Rekombinantna DNA tehnologija > Izmjena gena virusa i bakterija
European Union flag
Biologija 4 > Rekombinantna DNA tehnologija > Izmjena gena virusa i bakterija

4.1 Izmjena gena virusa i bakterija

Uvod

Prisjetite se kako se bakterije i drugi prokariotski organizmi razmnožavaju. Bakterije se razmnožavaju nespolno, a nakon svake diobe jedna se stanica podijeli na dvije stanice – klonove. Pojedinim se pak bakterijskim sojevima genom često mijenja. Neki su zahvaljujući brojnim mutacijama razvili i otpornosti na mnoge antibiotike. Razmislite i raspravite o tome kako je moguće da se organizmima, čiji je glavni način razmnožavanja nespolna dvojna dioba, genomi mogu brzo mijenjati?

Slika 4.1.1.: Sojevi zlatnoga stafilokoka (Staphylococcus aureus), poznati i kao MRSA, među najpoznatijim su superbakterijama današnjice. Te, u pravilu bezopasne bakterije, nalazimo na koži mnogih ljudi, no mogu izazvati infekciju u ljudi s otvorenim ranama i slabijim imunitetom. Sojevi koji se razvijaju u bolnicama brojnim su mutacijama razvili otpornost na mnoge antibiotike i otežavaju oporavak pacijenata nakon kirurških zahvata. Povećanje: x 1500.

  • Prisjetite se kako se bakterije i drugi prokariotski organizmi razmnožavaju.

Bakterije se razmnožavaju nespolno.
Nakon svake diobe jedna se stanica podijeli na dvije stanice – klonove. 
Pojedinim se bakterijskim sojevima mnogih vrsta genom često mijenja. 
Neki su bakterijski sojevi zahvaljujući brojnim mutacijama razvili i otpornost na mnoge antibiotike. 

  • Kako je moguće da se organizmima koji se razmnožavaju nespolnom dvojnom diobom mogu mutacijama brzo mijenjati genomi?
     

Na prikazu se na zelenoj površini vide raznoliko grupirane raznobojne kuglice podjednakih veličina.

Slika 4.1.1.: Sojevi zlatnoga stafilokoka (Staphylococcus aureus), poznati i kao MRSA, među najpoznatijim su superbakterijama današnjice. Te, u pravilu bezopasne bakterije, nalazimo na koži mnogih ljudi, no mogu izazvati infekciju u ljudi s otvorenim ranama i slabijim imunitetom. Sojevi koji se razvijaju u bolnicama brojnim su mutacijama razvili otpornost na mnoge antibiotike i otežavaju oporavak pacijenata nakon kirurških zahvata. Povećanje: x 1500.

Značaj bakterija i virusa za genetičko inženjerstvo

Za razvoj današnjih metoda genetičkoga inženjerstva bila su potrebna brojna otkrića poput Mendelovih zakona nasljeđivanja ili otkriće strukture molekule DNA Watsona, Cricka i Franklina. Osim znanja o tome kako je molekula DNA građena te kako ona funkcionira, potrebno je bilo razvijati i oruđe za njezinim manipuliranjem. Istraživanja na bakterijama vrlo su česta jer su bakterijske stanice izrazito jednostavne, a opet sadrže sav mehanizam potreban da proizvode nove biološki bitne spojeve. One se i veoma brzo razmnožavaju zbog čega su rezultati istraživanja vidljivi u kratkome roku.  

Slika 4.1.2.: Mikrobiologinja uzgaja kulture bakterija u mikrobiološkome laboratoriju.

Istraživanjem virusa otkriveni su mnogi mehanizmi vezanja za stanice, ubacivanja stranoga genskog materijala u stanicu i kontroliranje staničnoga metabolizma domaćina. Brojni mehanizmi virusnoga umnožavanja upotrebljavaju se u genetičkome inženjerstvu kao sredstvo izmjenjivanja genoma stanice domaćina.

Za razvoj današnjih metoda genetičkoga inženjerstva bila su potrebna brojna otkrića poput: 

  • Mendelovih zakona nasljeđivanja 
  • otkriće strukture molekule DNA Watsona, Cricka i Franklina. 

Potrebno je bilo:

  • znanje o tome kako je molekula DNA građena te kako ona funkcionira 
  • razvijanje oruđa za manipuliranjem molekulom DNA. 

Istraživanja na bakterijama vrlo su česta jer su:

  • bakterijske stanice izrazito jednostavne
  • sadrže sav mehanizam potreban da proizvode nove biološki bitne spojeve 
  • bakterijske se stanice veoma brzo razmnožavaju zbog čega su rezultati istraživanja vidljivi u kratkome roku. 

Mikrobiologinja sa zaštitnim rukavicama ispituje uzorke koji se nalaze iza plastičnoga panoa koji ju štiti od dodira s bakterijskim kulturama.

Slika 4.1.2.: Mikrobiologinja uzgaja kulture bakterija u mikrobiološkome laboratoriju.

Istraživanjem virusa otkriveni su:

  • mnogi mehanizmi vezanja za stanice 
  • ubacivanja stranoga genskog materijala u stanicu 
  • kontroliranje staničnoga metabolizma domaćina. 

Brojni mehanizmi virusnoga umnožavanja upotrebljavaju se u genetičkome inženjerstvu kao sredstvo izmjenjivanja genoma stanice domaćina.
 

Umnožavanje virusa

Virusi posjeduju jednostavne molekulske sustave kojima istražujemo kako funkcionira replikacija molekule DNA, transkripcija, translacija i dr. Da biste bolje istražili mogućnosti korištenja virusa u genetičkom inženjerstvu, istražite kako izgleda virusni genom i proučite osnovne korake prilikom umnožavanja virusa na primjeru bakteriofaga. Svaki virus unutar svoje proteinske kapside sadrži ili molekulu DNA ili molekulu RNA. Bakteriofazi su, primjerice, većinom DNA virusi. Njihov je genom dosta malen u usporedbi s genomima prokariotskih i eukariotskih stanica.


Slika 4.1.3.: Mikroskopska slika bakteriofaga (TEM). Prisjetite se građe kapside bakteriofaga. 

Proučite korake umnožavanja DNA virusa na primjeru bakteriofaga. Klikom na strjelice možete odabrati sljedeći ili prethodni korak.

Virusi posjeduju jednostavne molekulske sustave.
Molekulskim sustavima istražujemo kako funkcionira: 

  • replikacija molekule DNA
  • transkripcija
  • translacija i dr. 

Kako biste bolje istražili mogućnosti korištenja virusa u genetičkome inženjerstvu: 

  • istražite kako izgleda virusni genom
  • proučite osnovne korake prilikom umnožavanja virusa na primjeru bakteriofaga.

Svaki virus unutar svoje proteinske kapside sadrži: 

  • ili molekulu DNA 
  • ili molekulu RNA. 

Bakteriofazi su, primjerice, većinom DNA virusi. 
Genom DNA virusa dosta je malen u usporedbi s genomima prokariotskih i eukariotskih stanica.
 

Na plavoj podlozi vidi se struktura slična pauku s velikom šesterokutnom narančastozelenom glavom. Na glavu se nastavlja rep u obliku deblje ovojnice koja pri dnu završava sa šest člankovitih vlakana poput paukovih nogu.

Slika 4.1.3.: Mikroskopska slika bakteriofaga (TEM). Prisjetite se građe kapside bakteriofaga. 

Proučite korake umnožavanja DNA virusa na primjeru bakteriofaga. Klikom na strjelice možete odabrati sljedeći ili prethodni korak.

  • Proučite korake umnožavanja DNA virusa na primjeru bakteriofaga. 
  • Klikom na strjelice možete odabrati sljedeći ili prethodni korak.

Slobodni bakteriofag ima proteinske nastavke u svojoj kapsidi koji prepoznaju molekule membranskih receptora specifičnih za bakterijske stanice.

Bakteriofag se veže za specifične receptore na površini stanice domaćina. Ovisno o receptorima na površini membrane stanice domaćina, bakteriofag će imati sposobnost inficiranja većega ili manjega broja različitih vrsta bakterija.

Bakteriofag ispušta vlastitu nukleinsku kiselinu u citoplazmu stanice domaćina.

Stanični metabolizam domaćina primoran je replicirati nukleinsku kiselinu bakteriofaga. Molekula DNA stanice domaćina najčešće je uništena.

Ribosomi stanice domaćina proizvode proteine kaspide bakteriofaga koristeći se virusnom nukleinskom kiselinom kao nacrtom.

U citoplazmi stanice domaćina replicirane se virusne nukleinske kiseline pakiraju u novonastale kapside. Proizvedeni virioni najčešće izlaze iz stanice domaćina uništavajući joj membranu. Novi virioni mogu se vezati za novu stanicu domaćina i započeti novi ciklus.

Umnožavanje RNA virusa nešto je drukčije od onog prikazanog na primjeru bakteriofaga. Molekula RNA nekih virusa može se izravno iskoristiti kao mRNA na ribosomima stanice domaćina, a u drugih se ona mora dodatno modificirati. Mnogi RNA virusi sadrže gen za enzim RNA replikazu kojom će udvostručavati svoju virusnu RNA. Stanice svoje molekule RNA proizvode isključivo na kalup sadržan u molekuli DNA i ne sadrže enzime kojim bi već postojeću molekulu RNA kopirali.


Retrovirusi su posebna skupina RNA virusa koji svoju molekulu RNA prvo prepisuju u molekulu DNA koja se zatim može ugraditi u genom stanice domaćina i dalje umnažati i prepisivati uobičajenim staničnim mehanizmima. Retrovirusi sadrže gen za enzim reverznu transkriptazu kojim stvaraju komplementarnu DNA svojoj molekuli RNA.


Slika 4.1.4.: Prilikom pakiranja nukleinske kiseline u kapsidu HIV-a, osim molekule RNA, pakira se i enzim reverzna transkriptaza (plave točke). Nakon što prepozna novu stanicu domaćina, virus osim molekule RNA ubacuje i taj enzim kako bi se uopće mogla započeti reverzna transkripcija.

Genomi virusa i genomi svih stanica podložni su mutacijama. Genomi RNA virusa podložniji su mutacijama zbog manje preciznosti replikacije molekule RNA u odnosu na replikaciju molekule DNA. Nukleinske kiseline mogu i mutirati tijekom svakoga procesa replikacije. S obzirom na to da tijekom umnažanja jedne početne virusne čestice može nastati i stotine novih, stopa mutacije je češća. Istražite neke viruse za koje je poznato da često mutiraju i doznajte koju nukleinsku kiselinu sadrže.

Umnožavanje RNA virusa nešto je drukčije od prikaza na primjeru bakteriofaga. 

  • Molekula RNA nekih virusa može se izravno iskoristiti kao mRNA na ribosomima stanice domaćina.
  • U drugih virusa molekula RNA mora se dodatno modificirati. 

Mnogi RNA virusi sadrže gen za enzim RNA replikazu.
RNA replikazom udvostručit će svoju virusnu RNA. 
Stanice svoje molekule RNA proizvode isključivo na kalup sadržan u molekuli DNA. Stanice ne sadrže enzime kojom bi već postojeću molekulu RNA kopirali.
Retrovirusi su posebna skupina RNA virusa.  

  • Svoju molekulu RNA retrovirusi prvo prepisuju u molekulu DNA.
  • Takva se molekula DNA zatim može ugraditi u genom stanice domaćina.
  • U domaćinu se dalje takva molekula može umnažati i prepisivati uobičajenim staničnim mehanizmima. 

Retrovirusi sadrže gen za enzim reverznu transkriptazu.
S ovim enzimom stvaraju komplementarnu DNA svojoj molekuli RNA.

 

Prikazana je shema ulaska HIV-a u stanicu domaćina. Molekula RNA virusa pretvara se u molekulu DNA koja se zatim ugrađuje u DNA stanice domaćina. Iz tog ugrađenog dijela molekule DNA prepisuje se molekula RNA koja je smještena u novu virusnu kapsidu.

Slika 4.1.4.: Prilikom pakiranja nukleinske kiseline u kapsidu HIV-a, osim molekule RNA, pakira se i enzim reverzna transkriptaza (plave točke). Nakon što prepozna novu stanicu domaćina, virus osim molekule RNA ubacuje i taj enzim kako bi se uopće mogla započeti reverzna transkripcija.

Genomi virusa i genomi svih stanica podložni su mutacijama. 
Genomi RNA virusa podložniji su mutacijama zbog manje preciznosti replikacije molekule RNA u odnosu na replikaciju molekule DNA. 
Nukleinske kiseline mogu i mutirati tijekom svakoga procesa replikacije.
S obzirom na to da tijekom umnažanja jedne početne virusne čestice može nastati i stotine novih stopa, mutacija je češća. 

  • Istražite neke viruse za koje je poznato da često mutiraju i doznajte koju nukleinsku kiselinu sadrže.

Izmjena gena bakterija

Bakterijski genom sadržan je u kružnoj molekuli DNA, unutar nukleoida koja sadrži nekoliko stotina do nekoliko tisuća gena, ovisno o vrsti. Neke bakterije osim jednoga nukleoida imaju i jedan ili više plazmida. To su male kružne molekule DNA koje mogu nositi za bakteriju korisne dodatne gene. 

Slika 4.1.5.: Neke bakterije, osim nukleoida, mogu imati i više plazmida.

Iako se bakterije razmnožavaju isključivo nespolnim putom, postoje mehanizmi kojima bakterije mogu razmijeniti dio svoga genoma s drugim bakterijama. Tim mehanizmima u pojedinim bakterijama može doći do rekombiniranja molekule DNA. Tri su mehanizma rekombiniranja molekule DNA u bakterijama: transdukcija, konjugacija i transformacija.


Transdukcija
Transdukcija je prijenos dijela genoma jedne bakterijske stanice u drugu putem bakteriofaga. 

Slika 4.1.6.: Bakteriofazi se vežu za bakteriju E. coli (TEM).

 

Proučite korake transdukcije na primjeru prijenosa molekule DNA u bakteriofagu.

Bakterijski genom sadržan je u kružnoj molekuli DNA, unutar nukleoida.
Molekula DNA sadrži nekoliko stotina do nekoliko tisuća gena, ovisno o vrsti. 
Neke bakterije osim jednoga nukleoida imaju i jedan ili više plazmida. 
Plazmide su male kružne molekule DNA koje mogu nositi za bakteriju korisne dodatne gene.
Bakteriju vidimo kao produženi ovalni ružičasti oblik s trepetljikama po rubovima i jednim bičem. Unutar bakterije označen je nukleotid koji izgleda kao crvena duguljasta valovita nakupina koja se na krajevima sužava. Označene plazmide vidimo kao male bijele obruče unutar bakterije.

Slika 4.1.5.: Neke bakterije, osim nukleoida, mogu imati i više plazmida.

Bakterije se razmnožavaju isključivo nespolnim putom. 
Postoje mehanizmi kojima bakterije mogu razmijeniti dio svoga genoma s drugim bakterijama. 
Tim mehanizmima u pojedinim bakterijama može doći do rekombiniranja molekule DNA. 
Tri su mehanizma rekombiniranja molekule DNA u bakterijama: 

  • transdukcija
  • konjugacija  
  • transformacija.


Transdukcija


Transdukcija je prijenos dijela genoma jedne bakterijske stanice u drugu putem bakteriofaga. 
Vidi se polukružni dio bakterijske stanice smeđe drap boje i sedam bakteriofaga plavkaste boje s velikom glavom i repom. Četiri su bakteriofaga pričvršćena za stijenku bakterijske stanice.

Slika 4.1.6.: Bakteriofazi se vežu za bakteriju E. coli (TEM).

 

Proučite korake transdukcije na primjeru prijenosa molekule DNA u bakteriofagu.

Slobodni bakteriofag veže se za specifične receptore na površini stanice domaćina.

Bakteriofag ispušta vlastitu nukleinsku kiselinu u citoplazmu stanice domaćina i prilikom bilo kojega procesa umnožavanja.

Stanični metabolizam domaćina replicira nukleinsku kiselinu bakteriofaga, a ribosomi proizvode proteine virusne kapside. Virusni enzimi rascjepkaju bakterijsku DNA na fragmente: nukleoid i plazmide koje je stanica imala.

U vrlo rijetkim slučajevima u virusnu se kapsidu pogreškom pakira fragment bakterijske DNA umjesto virusne nukleinske kiseline.

Kapsida takva virusa opet prepoznaje specifične receptore na površini stanice domaćina i veže se za nju.

DNA koju virus ispušta u stanicu nije virusnoga podrijetla i neće izazvati umnožavanje novih čestica virusa.

    Moguća su tri scenarija koji opisuju što će se dogoditi unesenomu fragmentu bakterijske DNA:
  1. moguće je rekombiniranje postojećega bakterijskog nukleoida
  2. moguće je da se fragment zaokruži u novi plazmid
  3. fragment može biti razgrađen na nukleotide te iskorišten kao sirovina za replikaciju vlastite DNA.

Konjugacija
Konjugacija je mehanizam izmjene gena između dviju bakterijskih stanica putem konjugacijskoga mosta koji povezuje te dvije stanice.

Slika 4.1.7.: Mikroskopska slika bakterije E. coli koja ima F-plazmid (lijevo) konjugacijskim mostom se povezuje s drugom bakterijom koja nema F-plazmid (TEM).

Promotrite video koji prikazuje mehanizam konjugacije u bakterijama.

Konjugacija


Konjugacija je mehanizam izmjene gena između dviju bakterijskih stanica putem konjugacijskoga mosta koji povezuje te dvije stanice.

Vidi se ovalna stanica iz čijih rubova izlaze tamnije niti. Od stanice vodi duga bijela valovita tanka cijev (konjugacijski most) do druge jastučaste ovalne stanice bez ikakvih niti po rubovima.

Slika 4.7.: Mikroskopska slika bakterije E. coli s F-plazmidom (lijevo) koja se povezuje konjugacijskim mostom s drugom bakterijom koja nema F-plazmid (TEM).

  • Promotrite video koji prikazuje mehanizam konjugacije u bakterijama.
Prikazane su orkugle i duguljaste bakterije koje su povezane dugim tvorbama nalik na konop. Lijevo je prikazana bakterije koja unutar sebe ima kružnicu označenu kao F-plazmid. Ona s desne strane membrane ima i dugačku i tanku tvorbu - spolni pilus. S desne strane se nalazi druga bakterija i ona nema niti plazmid niti pilus. Lijeva bakterija se veže svojom tvorbom za desnu bakteriju. Jedna kopija one kružnice se kopira i kroz tu tvorbu kojom su povezane, dolazi u drugu bakterijsku stanicu. Obje stanice na kraju imaju i plazmid i spolni pilus.

Transformacija
Transformacija je mehanizam pri kojemu bakterije u određenim uvjetima unose dijelove (fragmente) molekule DNA iz svoje neposredne okoline. Bakterije katkad uneseni fragment molekule DNA ugrade u vlastiti genom unutar nukleoida ili od njega oblikuju novi plazmid.
Transformaciju je prvi put dokazao britanski mikrobiolog Frederick Griffith 1928. godine. Promotrite video o njegovu otkriću.
 

Transformacija


Transformacija je mehanizam pri kojemu bakterije u određenim uvjetima unose dijelove (fragmente) molekule DNA iz svoje neposredne okoline. 
Bakterije katkad uneseni fragment molekule DNA ugrade u vlastiti genom unutar nukleoida ili od njega oblikuju novi plazmid.
Transformaciju je prvi put dokazao britanski mikrobiolog Frederick Griffith 1928. godine. 

  • Promotrite video o njegovu otkriću.
U videu je prikazana kuglasta bakterija čiji se učinak, virulentnost testirao na miševima. Prikazana su dva postojeća soja te kuglaste bakterije: kuglice narančaste boje predstavljaju soj koji uzrokuje bolesti, a kuglice plave boje predstavljaju soj koji ne uzrokuje bolesti. Prikazan je dijagram s miševima i sojevima bakterija: Prvo je prikazan miš u kojeg je ubrizgan soj bakterija oblika plavih kuglica, taj miš je preživio. Zatim je prikazan miš u kojeg je ubrizgan soj narančastih bakterija - taj miš je uginuo. U trećeg je miša ubrizgan soj narančastih bakterija kraj kojih je prikazana skica plamena - bakterije su sterilizirane, a miš je preživio. U zadnjeg miša je ubrizgan soj narančastih bakterija sa skicom plamena i još jedan soj plavih bakterija, taj miš je uginuo.

U većini se slučajeva jedan od ovih triju načina izmjene genskoga materijala u bakterija događa među jedinkama iste vrste. U rijetkim slučajevima može se dogoditi izmjena i među jedinkama različitih vrsta bakterija. 

U većini se slučajeva jedan od ovih triju načina izmjene genskoga materijala u bakterija događa među jedinkama iste vrste. 
U rijetkim slučajevima može se dogoditi izmjena i među jedinkama različitih vrsta bakterija. 
 

Za kraj...

  • Virusi unutar kapside sadrže ili molekulu RNA ili molekulu DNA. Takvi se virusi međusobno razlikuju po mehanizmu umnožavanja.
  • Bakterije se razmnožavaju nespolno binarnom diobom i uglavnom im mutacije omogućuju gensku raznolikost.
  • Bakterije mogu povećati gensku raznolikost i jednim od triju procesa: transdukcijom, konjugacijom i transformacijom.
  • Transdukcija je prijenos dijela genoma iz jedne bakterije u drugu putem bakteriofaga.
  • Konjugacija je prijenos plazmida iz jedne bakterije u drugu putem konjugacijskoga mosta.
  • Transformacija je unos genskoga materijala iz okoline u bakterijsku stanicu.
     
  • Virusi unutar kapside sadrže ili molekulu RNA ili molekulu DNA. Takvi se virusi međusobno razlikuju u mehanizmu umnožavanja.
  • Bakterije se razmnožavaju nespolno binarnom diobom. Mutacije bakterijama uglavnom omogućuju gensku raznolikost.
  • Bakterije mogu povećati gensku raznolikost i jednim od triju procesa: transdukcijom, konjugacijom i transformacijom.
  • Transdukcija je prijenos dijela genoma iz jedne bakterije u drugu putem bakteriofaga.
  • Konjugacija je prijenos plazmida iz jedne bakterije u drugu putem konjugacijskoga mosta.
  • Transformacija je unos genskoga materijala iz okoline u bakterijsku stanicu.
     
1/5

Kojim se mehanizmom izmjena gena između dviju bakterija događa njihovim neposrednim kontaktom? 

2/5

Kako se naziva enzim koji HIV unosi sa sobom prilikom svake infekcije nove stanice? ✓×

Ispravan odgovor:

Kako se naziva enzim koji HIV unosi sa sobom prilikom svake infekcije nove stanice?

3/5

Koji je mogući kemijski sastav virusne kapside? 

4/5

Dodajte svakoj slici naziv mehanizma koji se u njima događa.

a)       

b)

c)

b)
✓ ×
1konjugacija
c)
✓ ×
2transdukcija
a)
✓ ×
3transformacija
Ispravni parovi:
a) → konjugacija
b) → transdukcija
c) → transformacija
5/5

Jedan soj bakteriofaga lambda koji napada bakteriju E. coli prilikom svakoga umnažanja prosječno stvori 36 novih viriona, virusnih čestica. 
Pretpostavite da se pogreškom u prosjeku tijekom jednoga umnažanja u 6 kapsida pakira bakterijska molekula DNA. 

Izračunajte koliko je prosječno izmijenjenih bakterija nakon samo dva uzastopna ciklusa umnažanja virusa. ✓×
 

Ispravan odgovor:

Jedan soj bakteriofaga lambda koji napada bakteriju E. coli prilikom svakoga umnažanja prosječno stvori 36 novih viriona, virusnih čestica. 
Pretpostavite da se pogreškom u prosjeku tijekom jednoga umnažanja u 6 kapsida pakira bakterijska molekula DNA. 

Izračunajte koliko je prosječno izmijenjenih bakterija nakon samo dva uzastopna ciklusa umnažanja virusa.
 

4.2 Metode genetičkog inženjerstva 4.1 Izmjena gena virusa i bakterija